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外泌体分离外泌体分离 外泌体(Exosomes)是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150 nm),其特指直径在40-100 nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体,这些外泌体通过转运关键蛋白和遗传物质,在细胞通讯和表达遗传中发挥着关键作用。且外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。通常采用离心法来进行外泌体分离。 1. 实验原理 利用分子的大小比重物理原理和多聚物的沉淀原理,使用离心法分离外泌体是至今为止最常用的方法。 此方法可大量提取、成本低、操作简单、耗时短。分离的外泌体可作为治疗靶标、药物或基因载体以及作为疾病标志物的应用,还在细胞与细胞间的物质和信息传递中起着重要的作用。 2. 实验步骤(不同样品分离步骤不同,以尿液为例) 2.1 将冻存品于25 ℃水浴中解冻,将完全融化后的样品置于冰上。 2.2 取25 mL尿液转移至离心管中,4 ℃,3000 g离心10 min,去除细胞碎片;若沉淀较多,可重复离心多次至无明显沉淀,取离心上清液。 2.3 离心上清液转移至50 ml离心过滤柱中;4 ℃,3000 g离心10 min,取过滤柱下室液体;若上室中有残留液体,可重复本步骤以获得更多样本量。 2.4在离心过滤后的上清液中加入Exosome Concentration Solution (ECS试剂),25 mL尿液加入5 ml ECS。 2.5 涡旋振荡混匀1 min后放置于4 ℃静置2 h。 2.6 取出装有混合液的离心管于4 ℃,10000 g离心1 h,marker笔标记沉淀位置,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒,静置1 min后,再次吸弃上清。 2.7 取Exosome Solution Buffer(ESB试剂)均匀吹打离心沉淀物,25 mL尿液加入0.5 mL ESB,待其溶解后,将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中。 2.8 4 ℃,12000 g,离心5 min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒。分装保存于-80 ℃;便于后续实验。 3. 结果示例 示意图(过滤法):首先去除细胞和细胞碎片,其次,过滤掉游离蛋白,浓缩样品。最后,去除大于100 nm的细胞外囊泡,得到外泌体。 参考文献 [1] Xu D, Tahara H. The role of exosomes and microRNAs in senescence and aging. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013;65:368–375. [2] Lobb, R. J. et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4 27031 (2015). [3] Vergauwen, G. et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017). [4] Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., & Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolationfrom plasma. J Extracell Vesicles. 427269 (2015). |