细胞增殖检测

细胞增殖

细胞增殖（cell proliferation）是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞增殖是评价细胞代谢、生理和病理状况的重要指标，常用的检测方法有BrdU染色、EdU染色和克隆形成等。

一、Brdu/EdU染色

1. 实验原理

BrdU（5-Bromo- 2’-deoxuuridine）是胸腺嘧啶的衍生物，可替代胸腺嘧啶选择性整合到新合成的DNA中（细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存在，并随着DNA复制进入子细胞中。利用BrdU特异性抗体可以检测掺入的BrdU，进而判断细胞的增殖能力。EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶掺入正在合成的DNA分子中，并基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接地检测出细胞的增殖能力。虽然BrdU和Edu两种方法都能检测细胞的增殖能力，但两者也有不同。Brdu抗体较大，必须先对DNA进行部分变性形成单链，才能与BrdU结合进而完成检测；而EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，无需DNA变性即可有效检测，可有效地避免样品损伤，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

2. 实验原理图

3. 实验步骤

3.1 BrdU染色

3.1.1 取对数生长期细胞，以每孔1×105个细胞（具体密度取决于细胞的生长率）接种到96孔板中，待细胞恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理；

3.1.2 添加配制的 10× BrdU溶液到平板孔中，以获得1×的最终浓度。

3.1.3 将细胞放入恒温器。一般的孵育时间为 1-24 h；

3.1.4 去除培养基。如是悬浮细胞，则以300 g的离心力离心10 min，随后弃去培养基；

3.1.5 按100 μL/孔添加 Fixing/Denaturing Solution，并将平板放在室温下

静置30 min，弃去溶液；

3.1.6 按100  μL/孔添加配制的1×BrdU抗体溶液，并将平板放在室温下1 h；

3.1.7 弃去溶液，用 1× Wash Buffer洗涤 3 次；

3.1.8 按 100 μL/孔添加配制的1× HRP标记二抗溶液，并将平板放在室温下 静置30 min，弃去溶液；平板用1× Wash Buffer洗涤 3 次。

3.1.9 添加 100 μL TMB Substrate；

3.1.10 室温孵育30 min；

3.1.11 添加 100 μL STOP Solution；

3.1.12 读取在450 nm处的吸光度（要获得最佳读数，则在添加 STOP Solution 30 min内读取平板）。

3.2 EdU染色

3.2.1 培养细胞的EdU标记及固定、洗涤和通透
3.2.1.1 取对数生长期细胞，以每孔1×105个细胞（具体密度取决于细胞的生长率）接种到96孔板中，待细胞恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理；
3.2.1.2 配制2× EdU工作液，37 ℃预热后，等体积加入96孔板中，使96孔板中的EdU终浓度变为1×。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议替换所有的培养液；
3.2.1.3 继续孵育细胞2 h。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常孵育时间为该细胞周期的10%左右；

3.2.1.4 EdU标记细胞完成后，弃去培养液，并加入1 mL固定液，室温固定15 min。
3.2.1.5 弃去固定液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次5 min。
3.2.1.6 弃去洗涤液，每孔用1mL通透液室温孵育15 min。
3.2.1.7 弃去通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞2次，每次5 min。

3.2.2 EdU检测
96孔板中每孔的反应体系为50 μL的反应混合物，6、12、24、48和384孔板对应的反应混合物体系分别为500 μL、200 μL、100 μL、70 μL和20 μL。

 3.2.2.1去除上述孔中的洗涤液，每孔加入50 μL Click反应液（参考下表组分顺序和体积配制Click反应液，并且在配制后15 min内使用），轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品；

3.2.2.2 室温避光孵育30 min。

3.2.2.3 吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次5分钟。

3.3.3 细胞核染色

为了检测细胞增殖的比例，可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。

3.3.3.1 吸除洗涤液后，每孔加1×Hoechst 33342溶液1mL，室温避光孵育10分钟。

3.3.3.2 吸除1× Hoechst 33342溶液。

3.3.3.3 用洗涤液洗涤3次，每次5分钟。

3.3.3.4 随后即可进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346 nm，最大发射波长为460 nm

4. 结果示例

     Edu标记正在进行DNA复制的细胞，在荧光显微镜下呈绿色；Hoechst 33342标记细胞的细胞核，显微镜下呈蓝色；绿色细胞数占蓝色细胞数的比值表示正在进行复制的细胞数占总细胞数的比例，其数值越高，表示细胞的增殖能力越强。对照组中未检测出正在增殖的细胞，实验组中检测到处于复制的细胞。

二、细胞克隆形成实验

1. 实验原理

细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。所谓克隆就是当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，反映细胞群体依赖性和增殖能力。由于细胞生物学性状不同，克隆形成率差别也很大。一般正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞克隆形成率强。克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。平板克隆形成实验主要应用于贴壁的细胞。软琼脂克隆形成实验主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。

2. 实验原理图

3. 实验步骤

3.1 平板克隆形成

3.1.1 将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；

3.1.2 培养板(6孔板)中接种400-1000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔）；

3.1.3 继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；

3.1.4 弃去培养基，PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min；

3.1.5 用PBS洗涤1次，每孔加入结晶紫染液1mL，染细胞10-20 min；

3.1.6 用PBS洗涤细胞数次，晾干，相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）；

3.2 软琼脂克隆形成

3.2.1 配制1.2%和0.7%琼脂糖，高压灭菌后，维持在42 ℃使其保持融化状态；

3.2.2 将1.2%琼脂糖胶与2×培养基1：1混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5 mL，室温等其凝固；

3.2.3 将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并调整细胞浓度为5×104/mL；

3.2.4 将0.7%琼脂糖胶与2×培养基1：1混合，加入100 μL细胞悬液，混合均匀后，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5 mL。

3.2.5 待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；

3.2.6 根据细胞的生长速度培养2-3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200 μL氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，37 ℃过夜，拍照。

4. 实验结果示例

平板克隆形成

细胞克隆形成后，经结晶紫染色呈蓝色；在相同的接种细胞数量下，细胞克隆的数量越多，细胞增殖能力越强。

软琼脂克隆形成

显微镜下可以看到分散的细胞克隆，克隆数占接种细胞数的比值可以衡量细胞的增殖能力；比值越高，增殖能力越强。

参考文献

[1] Matatall KA, Kadmon CS, King KY. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods Mol Biol. 2018;1686:91-103.

[2] Crane AM, Bhattacharya SK. The use of bromodeoxyuridine incorporation assays to assess corneal stem cell proliferation. Methods Mol Biol. 2013;1014:65-70.

[3] Diermeier-Daucher S, Clarke ST, Hill D, Vollmann-Zwerenz A, Bradford JA, Brockhoff G. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry A. 2009 Jun;75(6):535-46.

[4] Angelozzi M, de Charleroy CR, Lefebvre V. EdU-Based Assay of Cell Proliferation and Stem Cell Quiescence in Skeletal Tissue Sections. Methods Mol Biol. 2021;2230:357-365.

[5] Tang H, Liu J, Huang J. GMFG (glia maturation factor gamma) inhibits lung cancer growth by activating p53 signaling pathway. Bioengineered. 2022 Apr;13(4):9284-9293.

[6] Du F, Zhao X, Fan D. Soft Agar Colony Formation Assay as a Hallmark of Carcinogenesis. Bio Protoc. 2017 Jun 20;7(12):e2351.