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ELISAELISA ELISA，即酶联免疫吸附实验，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。 ELISA是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术，其作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特点。 1. 实验原理 ELISA主要基于抗原或抗体的两个特点：1）固定在载体表面的抗原或者抗体不会失活，仍然保留其免疫反应性；2）酶标记的抗体或者抗原既具有免疫学活性，还具有酶的催化活性的特点。ELISA的基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。在实际应用中，根据不同的设计，具体的方法和步骤可有多种，包含用于检测抗体的间接法，用于检测抗原的双抗体夹心法，以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。比较常用的是双抗体夹心法和间接法。 双抗体夹心法是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入含有抗原之待测样品，通过加入酶标记特异性抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。该方法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 间接法是将一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入无关蛋白载体封闭未结合位点后，加入待测样本，然后加入酶标二抗，经孵育和洗涤后，加底物显色。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。主要用于对病原体的检测而进行传染病的诊断。 2. 实验流程图
3. 实验步骤 3.1 双抗体夹心法检测抗原 3.1.1包被：用0.05 M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。 3.1.2 加样：加一定稀释的待测样本0.1 mL于上述已包被的反应孔中，置37 ℃孵育1 h后洗涤。需同时设置空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。 3.1.3 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1 mL。37 ℃孵育0.5~1 h后洗涤。 3.1.4 加底物液显色：于各反应孔中加入现用现配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃ 避光显色10-30 min。 3.1.5 终止反应：于各反应孔中加入2 M硫酸0.05 mL。 3.1.6 测定：在ELISA检测仪上，以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 min以内进行。 3.2间接法测定抗体 3.2.1 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1-10 μg/mL，每孔加0.1 mL，4 ℃过夜。次日洗涤3次。 3.2.2 加一定稀释的待测样本0.1 mL于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 h，洗涤，同时设置空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔。 3.2.3 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体0.1 mL，37 ℃孵育30-60 min。最后用DDW洗涤。 3.2.4 加底物液显色：于各反应孔中加入现用现配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃ 避光显色10-30 min。 3.2.5 终止反应：于各反应孔中加入2 M硫酸0.05 mL。 3.2.6 测定：在ELISA检测仪上，以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 min以内进行。
4. 结果示例
如图，将标准品倍比稀释后，通过测量OD值绘制标准曲线，通过测量样品的OD值，由标准曲线得出样品中待测物质的浓度
参考文献 [1]. Lequin RM. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin Chem. 2005 Dec;51(12):2415-8. [2]. Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 2015 Oct;72:4-15. [3]. Hornbeck P, Winston SE, Fuller SA. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 11:Unit11.2. [4]. Liao JJ, Lewis JW. Qualifying ELISA data: combining information. J Biopharm Stat. 2000 Nov;10(4):545-58.
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