ChlP实验

ChlP实验

ChIP（Chromatin Immunoprecipitation，简称染色质免疫沉淀）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。

1. 实验原理

在活细胞状态下通过固定细胞将细胞内的蛋白质－DNA复合物交联在一起，并通过酶处理的方式将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过特异性抗原抗体反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息，找出蛋白质结合的基因组位点。

2. 实验步骤

2.1细胞的甲醛交联与超声破碎

取出在培养板中培养的细胞，加入甲醛，使得甲醛的终浓度为1%；37°C孵育10 min后终止交联，吸尽培养基，用预冷的PBS清洗细胞2次。接着用细胞刮刀收集细胞于两个15 ml离心管中，离心弃上清，进行超声破碎。

2.2除杂及抗体孵育

超声破碎结束后，离心去除不溶物质，在100 μL的超声破碎产物中，各加入900 μL ChIP Dilution Bufer、20 μL × PIC和60 μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4 °C颠转混匀1 h后，4 °C静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min，取上清。各留取20 μL做为input。一管中加入1 μL抗体，另一管中则不加抗体。4 °C颠转过夜。

2.3检验超声破碎的效果

取100 μL超声破碎后产物，加入4 μL 5 M NaCl，65 °C处理2 h解交联后分出一半用酚/氯仿抽提。

2.4免疫复合物的沉淀及清洗

孵育过夜后，每管中加入60 μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA，4 °C颠转2 h。静置10 min后，离心弃上清，清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入洗涤溶液，在4 °C颠转10 min，再4 °C静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min，弃上清。清洗完毕后，开始洗脱。解交联:每管中加入20 μL 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M）混匀，65 °C解交联过夜。

2.5 DNA样品的回收

解交联结束后，每管加入1 μL RNAaseA(MBI)，37 °C孵育1 h。每管加入10 μL 0.5 M EDTA、20 μL 1 M Tris.HCl（pH6.5）2 μL10 mg/mL蛋白酶K。45 °C处理2 h。最后回收DNA片段。

2.6 PCR、qPCR 或者测序分析。

3. 结果实例

此结果图，阳性对照组条带清晰无杂带，阴性对照组正常，表明ChIP实验结果可信。Input对照组条带清晰可见，表明PCR扩增引物可用于该指标的检测。

参考文献

[1] Zhang, X.Guo,C. Chen, Y. Shulha, H.P. Schnetz, M. P.LaFramboise, T.Bartels, C. F.Markowitz, S. Weng Z.Scacheri, P. C. and Wang, Z. (2008) Epitope tagging of endogenous proteins for genome-wide ChIP-chip studies. Nat.Methods 5, 163–165.

[2] Haring M., et al. Chromatin immunoprecipitation:optimizationquantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).

[3] Nelson, J.D, Denisenko, O. & Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat. Protoc. 1, 179–185 (2006).

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