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免疫印迹（western blotting）免疫印迹（western blotting） 免疫印迹（western blotting）是利用抗原抗体特异反应特性，定性检测样本中目的蛋白表达量；是检测基因蛋白表达量最常用的方法，广泛应用于基础科研领域。 1. 实验原理 在电场作用下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将总蛋白根据分子量大小进行分离，然后将其转印至固相载体（硝酸纤维膜或PVDF膜）。载体膜与特异识别特定抗原的抗体孵育后，再与辣根过氧化物酶标记的二抗特异结合。最后加入辣根过氧化物酶底物显色（暗室曝光或化学发光成像），结合显色条带光密度分析目标蛋白表达量。 2. 实验步骤 2.1 总蛋白提取 2.1.1 组织样本：组织块用预冷的PBS洗涤2-3次，去除血污，称重，剪成小块置于匀浆管中，加入匀浆珠，每10 mg组织加入100 μL组织裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），设置匀浆程序进行匀浆。匀浆结束后，放置冰上孵育30 min，每隔5 min震荡1次确保组织完全裂解。12000 rpm，4 ℃，离心10 min，收集上清，即为组织总蛋白溶液。 2.1.2 细胞样本：弃去培养板中的培养基，加入适量4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2-3次，并弃去洗涤液。按说明书加入适量裂解液（含PMSF和磷酸酶抑制剂）至培养板中，使用移液器吹打混匀，冰上孵育20 min。 裂解完成后，用移液器将裂解液移至2 mL离心管中，并4 ℃，12000 rpm，离心10 min，收集上清，利用BCA法测定蛋白溶液浓度，并且将各组样本蛋白浓度均一化，调整至相同浓度。保存上清于-20 ℃或-80 ℃备用。 2.2 凝胶电泳 2.2.1制胶: 根据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶，沿玻璃板上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中，待分离胶聚合凝固后，灌注浓缩胶溶液并立即插入胶梳，充分聚合后即可使用。 2.2.2蛋白变性：取出细胞裂解液按比例加入5×Loading Buffer混匀，于沸水中煮沸5 min，立即冰上放置。 2.2.3上样电泳：正确放置电泳槽，加入电泳液，上样，先恒压80 V电泳25 min，待溴酚蓝指示蛋白压缩完成后，将电压调至120 V，继续电泳，直到溴酚蓝快要到达凝胶底部。 2.3 电转移 将凝胶玻璃板从电泳槽中取下，切去不用的部分，根据凝胶的尺寸剪裁和凝胶一样大小的固相膜，再放入电转膜液中浸泡激活；同时剪裁2张滤纸，放入转膜缓冲液中泡透。按阴极→滤纸→凝胶→固相膜→滤纸→阳极的顺序放置在转膜仪上，赶压气泡。接通电源，选择恒流模式，按1.5 mA/cm2凝胶计算转膜用电流，转膜45 min。 2.4 免疫反应 2.4.1 将膜用TBST冲洗5 min后，移至用TBST配置的5%脱脂奶粉封闭液中，室温下摇床上封闭2 h。 2.4.2 将一抗用抗体稀释液稀释至适当浓度，从封闭液中取出膜，再放入新抗体孵育袋中，加入一抗液，挤赶气泡，封口，4 ℃ 孵育过夜。 2.4.3 次日取出膜，用TBST在室温下摇床上洗涤3次，每次5 min。 2.4.4 根据一抗准备相应种属二抗稀释液并与膜一起孵育1 h。 2.4.5 转移二抗稀释液，用TBST在室温下摇床上洗3次，每次5 min。 2.4.6 显色液A、B液比例为1：1，化学发光，采集照片，保存原始图片。 3. 结果示例
该结果反应了不同样本，在相同处理及检测条件下能清晰的看出蛋白表达情况。（右图为对照内参GAPDH）
使用红外荧光的高质量和低质量的蛋白质印迹图像的一个例子。用DMSO(CTL)或2 μM的MEK抑制PD0325901(MEKi)处理WM793黑色素瘤细胞18 h。选用的是兔抗磷酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204)、小鼠抗总ERK1/2。第一个Western blot面板是同时检测磷酸化ERK1/2(800nm通道-绿色)和总ERK1/2(700nm通道-红色)荧光信号的叠加。第二个和第三个面板是磷酸化和总ERK1/2的单通道荧光图像的黑白图像。
参考文献 [1] G.J. Anderson, C.M. Cipolla, R.T. Kennedy, Western blotting using capillary.electrophoresis, Anal. Chem. 83 (2011) 1350–1355. [2] A.J. Hughes, A.E. Herr, Microfluidic western blotting, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2013) 21450–21455. [3] S.Q. Tia, M. He, D. Kim, A.E. Herr, Multianalyte on-chip native western blotting,Anal. Chem. 83 (2011) 3581–3588. [4] S. Jin, G.J. Anderson, R.T. Kennedy, Western blotting using microchip electrophoresis interfaced to a protein capture membrane, Anal. Chem. 85 (2013) 6073–6079. [5] A.J. Hughes, D.P. Spelke, Z.C. Xu, et al., Single-cell western blotting, Nat. Methods 11 (2014) 749–755.
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