外泌体鉴定

外泌体鉴定

在外泌体研究中，外泌体鉴定是继分离之后的关键步骤。其目的是为了判断样本是否含有外泌体，是否可以表达特异性的外泌体标志蛋白，是否落在外泌体常规的粒径范围。为了更好的进行生物学功能学、形态学研究和生物标记研究，需要对分离后的外泌体来进行鉴定。我们鉴定的方法主要有透射电镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白标志物检测（western blotting）。

1. 实验原理

外泌体透射电镜鉴定外泌体大小、形态，可观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形）；通过粒子直径分析系统测算和统计样品中粒子的直径分布，能保证外泌体原始状态；将外泌体蛋白裂解后，通过蛋白标志物CD9，CD63，TSG101的检测，来确定外泌体中是否有相关蛋白的表达。

2. 实验步骤

2.1 TEM鉴定

首先将外泌体用戊二醛固定，之后将5-10 μL外泌体溶液滴加到铜网上，室温吸附10 min左右，用滤纸小心吸去多余的液体。然后向铜网上滴加10 μL 2%的磷钨酸溶液 ( pH=6.5 )，在室温下对外泌体染色处理2 min，小心用滤纸吸去多余的染色液，将铜网在室温下晾干，上机检测。

2.2 NTA鉴定

分离好的外泌体，样本取用量一般在2 μL-100 μL不等，上机检测，zetaview软件可以分析获取特定粒径区间内的颗粒浓度。

2.3蛋白标志物检测

将外泌体，按照Western boltting实验步骤，进行CD9、CD63、TSG101三个标志物检测。

3. 结果示例

Western boltting检测结果显示提取的外泌体可成功检测到标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。

上图NTA结果是经AuNPs处理的人巨噬细胞释放的外泌体，显示了外泌体分布、浓度（绝对计数）和折射率的汇总。

通过电镜检测抽提到的外泌体形态和大小判断，抽提到为外泌体。

参考文献

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