如何用逆向思维研究癌症调控机制

日期:2019-01-16 15:25:33



长链非编码(long non-coding RNAs lncRNAs)现如今在癌症的发生发展中是一个研究热点,最常见的作用方式是通过海绵结合miRNAs发挥作用。在大多数的研究中,通常是已知研究lncRNAs,通过生物信息学筛选、二代测序等方式,寻找能够海绵结合的miRNAs;而今天解读的这篇文献,是通过已知研究的miRNAs,寻找能够海绵结合的lncRNAs


一、筛选和鉴定与肝癌耐药相关的候选miRNA

该研究采用TRAIL非耐药肝癌细胞株HepG2SBel-7402S,以及TRAIL耐药肝癌细胞株HepG2R Bel-7402R进行研究。首先使用MTT试验验证了耐药细胞株的HepG2RBel-7402R耐药性(图1A)。

紧接着,由于TRAIL诱导的细胞凋亡是以caspase依赖的方式进行的,因此,在上述四株细胞株中,检测了CASP8CASP3mRNA和蛋白的表达情况,结果表明两者的表达量在耐药细胞株中均下调(图1B-C)。




为了研究其中的耐药机制,该研究使用在线工具(TargetscanRNA22,miRWalkStarbase)搜索可能调控caspase 3caspase8的候选miRNA。结合GEO数据库,选择耐药肿瘤细胞中的非下调miRNA (1D)。在筛选出的这些miRNA中,通过构建mimic过表达模型发现,对caspase8下调力度最强的是miR-24-3p,对caspase 3下调力度最强的是miR-221(图1E-F)。


二、MiR-24/miR-221促进肝癌细胞对TRAIL的抗性

选取上述研究中选取的miR-24miR-221,通过构建过表达和敲降的细胞模型,采取Q-PCR、流式细胞术等实验,证明miR-24miR-221促进肝癌细胞对TRAIL的抗性(图2)。



三、MiR-24/miR-221通过直接靶向负性调控caspase8/3

为了进一步确证miR-24/miR-221caspase 8/3的调控作用,本部分研究采用了荧光素酶报告基因试验、和Western blot实验,证明了miR-24/miR-221通过直接靶向负性调控caspase 8/3(图3)。


四、抑制CASC2能促进TRAIL抗性

前期的研究报道证明,在肝癌中CASC2能抑制肝癌的增殖。因此,该研究在耐药细胞株HepG2R Bel-7402R中敲降CASC2,使用MTT实验和流式细胞术,证明敲降CASC2能够抑制细胞的TRAIL抗性(图4)。


五、CASC2通过直接靶向对miR-24miR-221进行负调控

 通过miRCode预测显示,CASC2 miR-24/miR-221有直接作用的位点,因此,该研究设计了荧光素酶报告基因试验和RIP实验验证,并且敲降CASC2miR-24miR-221的表达量显著提高,证明了CASC2通过直接靶向对miR-24miR-221进行负调控(图5)。


六、CASC2通过miR-24/miR-221调节TRAIL抗性

该部分实验通过在耐药细胞株HepG2R Bel-7402R中敲降CASC2/miR-24/miR-221进行营救实验,使用MTT试验和流式细胞术,证明了CASC2通过miR-24/miR-221调节TRAIL抗性,并且通过Western blot实验验证了CASC2/ miR-24/miR-221caspase 8/3的调控作用(图6)。


总结:该研究是一项比较经典的lncRNA/miRNA/蛋白对于癌症的调控作用的研究,不过该研究的出发点是蛋白(caspase 8/3),随后找到调控蛋白的miRNAmiR-24/miR-221),最后找到调控miRNAlncRNACASC2),完成了这一调控路径。这种逆向的研究思路,或许值得大家借鉴一下。



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